StartseiteLänderEuropaEuropa: Weitere LänderERA-NET EuroTransBio-10: MetaDiC - Unter Verwendung eines neuartigen Verfahrens werden gezielt krebsrelevante Gene in patientenabgeleiteten Pankreastumorzelllinien ausgeschaltet. Ziel ist es ein Modellsystem zur Wirkstoffentwicklung und Suche nach diagnostischen Biomarkern zu entwickeln.

ERA-NET EuroTransBio-10: MetaDiC - Unter Verwendung eines neuartigen Verfahrens werden gezielt krebsrelevante Gene in patientenabgeleiteten Pankreastumorzelllinien ausgeschaltet. Ziel ist es ein Modellsystem zur Wirkstoffentwicklung und Suche nach diagnostischen Biomarkern zu entwickeln.

Laufzeit: 01.12.2015 - 30.11.2019 Förderkennzeichen: 031B0093B
Koordinator: NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut an der Universität Tübingen

Ziel der am NMI durchgeführten Arbeiten ist die zielgenspezifische, CRISPR/Cas9-basierte genomische Editierung von patientenabgeleiteten Pankreaskrebszelllinien. Der Knockout jedes ausgewählten Zielgens wird auf Genom- und Protein-Ebene validiert. Das NMI wird Auswirkungen der Zielgen-Knockouts sowie von Wirkstoffbehandlungen auf Signaltransduktionsprozesse dieser Zelllinien untersuchen, um neue Ansatzpunkte für alternative Therapien von Pankreastumoren zu identifizieren. Zur Verringerung von off-target Effekten wird die "paired nickase" Strategie zur Generierung von CRISPR-Knockout-Zelllinien eingesetzt. Dazu wird die Cas9D10A Nickase stabil in einen "safe harbor"-Lokus des Genoms von 5 etablierten und 5-10 patientenabgeleiteten Pankreastumorzelllinien integriert. Dann werden unter Verwendung web-basierter Plattformen für 3 ausgewählte Zielgene jeweils 5 gRNA Sequenzpaare identifiziert und in Expressionsvektoren kloniert. Nach Sequenzvalidierung werden diese Konstrukte transient in die Cas9D10A-Pankreaskrebszelllinien transfiziert. Durch limiting dilution werden Einzelzellklone generiert und per PCR auf erfolgreichen Zielgen-Knockout gescreent. In positiven Klonen wird der Knockout auf Proteinebene sowie per Sequenzierung bestätigt. Die hergestellten Knockout-Zelllinien werden von den Verbundpartnern zur Herstellung und Wirkstoffbehandlung von CRISPR-Organoid- und Xenograft-Modellen eingesetzt. Das NMI wird in diesen unterschiedlich behandelten Modellen unter Einsatz der qRT-PCR-Array-Plattform (Quantstudio 12K Flex OpenArray, Life Technologies) Expressionsprofile von 896 Genen bestimmen und analysieren. Die erhaltenen Daten sind von entscheidender Bedeutung bei der Charakterisierung von Knockout-induzierten Veränderungen der Signaltransduktion, welche Unterschieden der Knockout-Modelle beim zellulären Phänotyp und bei der Sensitivität gegenüber Substanzbehandlungen zugrunde liegen.

Verbund: ERA-NET EuroTransBio 10: MetaDiC Quelle: Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) Redaktion: DLR Projektträger Länder / Organisationen: Österreich Themen: Förderung Lebenswissenschaften

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